液相色譜法是一種以液體為流動(dòng)相的色譜法，液相色譜法是現(xiàn)在應(yīng)用**廣泛的一種液相色譜法，這種方法是20世紀(jì)60年代興起的，經(jīng)過(guò)不斷的完善和發(fā)展，現(xiàn)已被應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。在醫(yī)藥分析領(lǐng)域，液相檢驗(yàn)的應(yīng)用已經(jīng)普及，而液相色譜法作為液相檢驗(yàn)中的一種重要手段，也得到了大力的推廣與應(yīng)用，目前實(shí)驗(yàn)室常用的P230液相色譜儀。

　　液相色譜法及其系統(tǒng)構(gòu)造

　　液相色譜法是以經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，通過(guò)引入氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來(lái)的。區(qū)別于經(jīng)典液相色譜法柱效低、時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)，液相色譜法采用了高壓泵、固定相和高靈敏度檢測(cè)器等技術(shù)，因此其檢測(cè)有高壓、高速、、高靈敏度、檢驗(yàn)速度快、分辨率高等特點(diǎn)，更適宜于分離、分析熱穩(wěn)定性差、高沸點(diǎn)、有生理活性及相對(duì)分子量比較大的物質(zhì)。

　　HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、溶劑貯存器、檢測(cè)器、檢測(cè)數(shù)據(jù)記錄器等組成。其中輸液泵、色譜柱和檢測(cè)器關(guān)鍵。制備型HPLC儀有餾分收集裝置。新型HPLC儀增加了微機(jī)控制，可進(jìn)行自動(dòng)化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。

　　輸液泵性能的好壞直接影響分析結(jié)果的可靠性，好的輸液泵應(yīng)具備輸出壓力高，流量穩(wěn)定、耐腐蝕，密封性能好，液缸容積小等特點(diǎn)；HPLC進(jìn)樣方式可分為：隔膜進(jìn)樣、閥進(jìn)樣、停流進(jìn)樣、自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣裝置需要：密封性能好，重復(fù)性好，死體積小，對(duì)色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響??；色譜柱擔(dān)負(fù)分離作用，是色譜系統(tǒng)的心臟，在選擇色譜柱時(shí)要注意選擇柱效高、選擇性好，分析速度快的色譜柱；檢測(cè)器是把洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，其要求線性范圍寬、靈敏度高、重復(fù)性好、噪音低和適用范圍廣。

　　液相色譜的試驗(yàn)方法及分類

　　液相色譜的試驗(yàn)方法主要依靠分離機(jī)制，其分離方法有多種，相應(yīng)的分離機(jī)制也不同。根據(jù)分離機(jī)制的不同主要有四種基本類型色譜法：吸附色譜、分配色譜、分子排阻色譜及離子交換色譜法，其他還有膠束色譜法、化學(xué)鍵合色譜法及親和色譜法等類別。在液相檢驗(yàn)中，分離是核心，而色譜是一種分離分析手段。無(wú)論是那種分離方法，其分離試驗(yàn)方法都是一個(gè)物理過(guò)程，與液相層析的試驗(yàn)方法相似：將要檢測(cè)分析的化合物通過(guò)進(jìn)樣器放入液相色譜儀，流動(dòng)相攜帶著其流過(guò)色譜柱，由于不同物質(zhì)在固定相上的保留時(shí)間不同出現(xiàn)的峰高或者峰面積定量以及出峰時(shí)間的不同而達(dá)到分離，從而或檢測(cè)**中不同成分的含量、或分析藥效，或測(cè)定**殘留物雜質(zhì)成分的濃度。

　　**含量檢驗(yàn)中液相色譜的應(yīng)用

　　**含量檢驗(yàn)中定量分析的準(zhǔn)確與否，關(guān)鍵在于檢測(cè)器所產(chǎn)生的信號(hào)是否與被測(cè)樣品的量始終呈**的函數(shù)關(guān)系。液相色譜儀可使輸出信號(hào)與樣品量好呈線性關(guān)系，這樣進(jìn)行定**含量測(cè)定時(shí)既準(zhǔn)確又方便。

　　例如，示差檢測(cè)法就是用液相色譜測(cè)定多糖類**，用電化學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)的陰離子交換柱分離出多糖類**，這種方法優(yōu)于傳統(tǒng)檢驗(yàn)法，可直接對(duì)低濃度糖作定量分析，不需衍生和樣品處理，在節(jié)約時(shí)間和資金的同時(shí)避免了有毒衍生試劑的使用。在檢驗(yàn)中不同類型的糖(如單糖、糖胺聚糖、半乳糖、果糖等)適用于不同的離子交換柱。

　　藥效檢驗(yàn)中液相色譜的應(yīng)用

　　**的**效果取決于人體對(duì)**的吸收，與**成分及其代謝物在血液中的濃度有關(guān)。隨著現(xiàn)代**的選擇性越來(lái)越高，所服用的劑量越來(lái)越低，這就需要提高藥效?，F(xiàn)階段藥效臨床試驗(yàn)中采用人肝組織，選擇液相色譜法檢測(cè)藥性藥效，對(duì)混合物中微量組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，可搭配固定相和流動(dòng)相以達(dá)到好的分離效果。

　　例如，用內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)血液中**濃度的總量限度。內(nèi)標(biāo)法是液相色譜的一種常用測(cè)定方法。首先提取血液，然后根據(jù)規(guī)定的方法配制不含**的溶液，注入到液相色譜儀中，記錄為色譜圖I，然后再配制含有**的溶液，以相同的條件注樣，記錄為色譜圖II。然后將圖I與圖II進(jìn)行比較，則可以通過(guò)雜質(zhì)峰確認(rèn)雜質(zhì)峰的面積，從而達(dá)到檢驗(yàn)的效果。

　　**殘留中液相色譜的應(yīng)用

　　通常**在使用一段時(shí)間后在體內(nèi)產(chǎn)生殘留物會(huì)影響認(rèn)得某些生理功能，也就是人們所說(shuō)的食藥三分毒，如何分析**殘留物成分，減少其引起的不必要危害，液相色譜法起到了重要的作用。質(zhì)譜儀是完成**代謝物毒性鑒定的主要工具，是制藥工業(yè)中毒理學(xué)試驗(yàn)的基礎(chǔ)。

　　今后的醫(yī)藥分析檢驗(yàn)研究中，可以應(yīng)用液相色譜法不受試樣揮發(fā)性限制等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合其它的先進(jìn)技術(shù)，如色譜——光譜聯(lián)用、柱切換技術(shù)、傅立葉變換紅外線吸收光譜聯(lián)用等，不斷提高液相色譜在液相檢驗(yàn)中的應(yīng)用。

　　液相色譜儀分離的目的必須**明確，下面的問(wèn)題在建立方法之初就應(yīng)確定：　　（1）主要目的是什么？定量或定性，還是定性、定量同時(shí)做？；　?。?）是否有必要解析出樣品的所有成分？譬如可能有必要分離出產(chǎn)品中的所有降解物或雜質(zhì)，以使含量測(cè)定結(jié)果更加可靠，但卻沒(méi)必要將它們彼此**分開(kāi)。　?。?）如要求定量分析，準(zhǔn)確度與精密度需多大？樣品主要成分的精密度通常能達(dá)到±1—2%，特別是不需樣品預(yù)處理的情況?！　。?）特殊化合物可能會(huì)以不同的樣品形式出現(xiàn)（如：原料藥，一種或多種形態(tài)，環(huán)保樣品等）。是否需要一種以上的HPLC方法？單一方法分離不同形態(tài)樣品是否理想？　　（5）一次將分析多少樣品？當(dāng)必須同時(shí)處理大量樣品時(shí)，運(yùn)行時(shí)間將變得非常重要?！　∮袝r(shí)甚至為了縮短運(yùn)行時(shí)間而以犧牲樣品分離度作代價(jià)，如縮短柱長(zhǎng)或加快流速。當(dāng)一次分析的樣品數(shù)目超過(guò)10個(gè)，運(yùn)行時(shí)間一般應(yīng)控制在20min以內(nèi)?！　。?）將要使用該方法的實(shí)驗(yàn)室中，有哪些HPLC設(shè)備？色譜柱能否恒溫系統(tǒng)能否做梯度洗脫？該方法是否可在不同設(shè)計(jì)與生產(chǎn)的設(shè)備上運(yùn)行？　　方法建立實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前，應(yīng)明確對(duì)方法的這些要求。