【***** 使用手冊(cè)】液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography HPLC)又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。如今，該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)應(yīng)用。尤其是在**分析領(lǐng)域，有著廣泛的應(yīng)用?！　∫合嗌V在**分析中的應(yīng)用，主要考慮試樣的預(yù)處理和分析柱、檢測器的選擇。在試樣的預(yù)處理上，日前興起的固相(微)萃取使得許多含量低的成分得到精制提純，從而適于液相色譜的測定。中藥中有些紫外吸收，或無特征紫外吸收的成分，直接用液相色譜測定，其靈敏度和分離度都不盡人意，利用柱前或柱后衍生化法可使這些成分較地測定出來。對(duì)于極性大、脂溶性差物質(zhì)，在YWGCl8柱上不易保留，用十二烷基磺酸鈉作為離子對(duì)試劑，降低其極性，延長柱上的保留時(shí)間，取得較好的分離較果?！　⒁合嗌V和質(zhì)譜這兩個(gè)強(qiáng)有力的分析技術(shù)在線連接在一起，經(jīng)過三十年的發(fā)展已成為一項(xiàng)較為成熟的分析手段，但是它從形成伊始就存在著問題：從液相色譜流進(jìn)質(zhì)譜時(shí)，流動(dòng)相的變化、溶劑的組成、高溫高壓離子化的問題制約著這種聯(lián)用技術(shù)發(fā)展。大氣壓離子化接口具有去除溶劑和離子化的雙重功效，它的引入使得該技術(shù)在各個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。電噴霧離子源是一種軟電離技術(shù)，一般只生成(M H) 和(M-H)-兩種分子離子峰，選擇性監(jiān)測(mz)190的負(fù)分子離子峰，具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度、專一性，滿足了低濃度**研究的需求?！　∪S液相色譜法可以同步測定葛根素和阿魏酸兩種指標(biāo)。通過實(shí)驗(yàn)證明：如果選擇合適的柱溫等色譜條件，乙醇作為反相液相色譜流動(dòng)相，分析中藥及中成藥中有效成分，既**又準(zhǔn)確。結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，普通的檢測器難以檢測出來，液相色譜-電化學(xué)法可以有效地測定黃連粉中僅差一個(gè)基團(tuán)的黃芩苷和黃芩素的含量。樣品經(jīng)色譜柱分離后收集，再經(jīng)熒光分光光度計(jì)測熒光強(qiáng)度，影響因素多，測定復(fù)雜。改進(jìn)后的液相色譜-熒光法則可以不經(jīng)衍生化和收集分離物，只經(jīng)化學(xué)處理除雜，濃縮后直接進(jìn)樣即可。用該法測定貫葉連翹中金絲桃素的含量也取得了較好的結(jié)果。液相色譜-示差折光測黃芪精口服液中黃芪甲苷的含量也都取得了較為滿意的結(jié)果。對(duì)于只有紫外末端吸收，用紫外檢測時(shí)靈敏度低，基線易漂移，示差折光檢測其易受外界條件干擾，蒸發(fā)散射檢測器能克服以上不足，響應(yīng)值只與樣品質(zhì)量有關(guān)，其信號(hào)相應(yīng)與質(zhì)量成正比，不同化合物，質(zhì)量相同則信號(hào)相應(yīng)基本一致。蒸發(fā)光散射檢測法是基于不揮發(fā)樣品分子對(duì)光的散射程度與其質(zhì)量成正比，與其所含基團(tuán)性質(zhì)無關(guān)。只要選擇適當(dāng)?shù)臋z測器參數(shù)，便可使流動(dòng)相和溶劑**氣化，不產(chǎn)生信號(hào)，而樣品中的各個(gè)組分以不揮發(fā)粒子存在，對(duì)光有散射，以被檢測出來。因此，蒸發(fā)光散射檢測器可用于含不同基團(tuán)的多組分同時(shí)分離、分析。和紫外、熒光等方法相比，蒸發(fā)光散射檢測法對(duì)不同物質(zhì)有近似相同的響應(yīng)因子?！　≡谡劦剿幱幂o料檢測中的其他液相色譜檢測方法時(shí)，液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)作為微量元素測定的有效途徑之一，液相色譜高分離度與電感耦合等離子體質(zhì)譜低檢測性、寬動(dòng)態(tài)線性范圍及能同時(shí)測定多種元素、跟蹤元素的變化等特點(diǎn)融合，目前已廣泛的用于食品、環(huán)境、體內(nèi)外**分析中微量元素的測定。該方法應(yīng)用于藥用輔料中微量元素砷、汞、鉻等檢測的探索性研究項(xiàng)目已在試驗(yàn)室開展。目前雖罕見相關(guān)報(bào)道，隨著技術(shù)的成熟與儀器的發(fā)展，其在藥用輔料檢測中有著廣泛的應(yīng)用前景。同時(shí)，液相色譜-核磁共振聯(lián)用技術(shù)因儀器昂貴，核磁共振靈敏度相對(duì)較低，液相色譜需使用氘代溶劑，溶劑信號(hào)易對(duì)樣品產(chǎn)生干擾等，使其在**分析中廣泛應(yīng)用存在**障礙，但核磁共振在結(jié)構(gòu)分析方面有獨(dú)特的優(yōu)勢，能夠提供豐富的結(jié)構(gòu)信息，彌補(bǔ)液相色譜通用檢測器只能得到非常有限的結(jié)構(gòu)信息的不足，在實(shí)際藥用輔料雜質(zhì)分析中已進(jìn)入使用階段?！　【C合上述研究成果可以知曉，目前液相色譜法在**分析領(lǐng)域的應(yīng)用是多方面的。而且為了滿足特定的檢測需求，液相色譜與多種其他方法、其他儀器聯(lián)合，不斷改進(jìn)自身缺陷，為**分析提供更佳的解決方案。相信這項(xiàng)技術(shù)在未來還會(huì)有更廣闊的應(yīng)用空間。 液相色譜流動(dòng)相說明

　　流動(dòng)相相當(dāng)于液相的血液，可以想象對(duì)液相的重要程度。那么流動(dòng)相都需要注意什么呢?　　01、過濾溶劑　　溶劑在使用前**要用0.5μm的過濾器過濾，如果使用固體化學(xué)試劑(緩沖鹽)配制流動(dòng)相，過濾特別重要，不能讓固體微粒污染泵，阻塞進(jìn)樣器和柱頭過濾片。本實(shí)驗(yàn)室有水溶性和脂溶性兩種過濾膜供選擇(反光面朝上)，過濾水溶性流動(dòng)相時(shí)(如甲醇/水)，先用1～2mL甲醇潤濕過濾膜，有助于快速抽濾?！　?2、保持儲(chǔ)液瓶的清潔　　用普通溶劑瓶作流動(dòng)相儲(chǔ)液器應(yīng)不定期廢棄瓶子，***后一次應(yīng)用HPLC級(jí)的水或溶劑清洗，不能在清洗過程中留下污跡?！　?3、保證溶劑的質(zhì)量　　**要用HPLC級(jí)的溶劑，水也應(yīng)達(dá)到HPLC級(jí)，同樣也要使用高純度的緩沖鹽?！　∫恍┮蛄鲃?dòng)相引起的常見問題　　01、流動(dòng)相脫氣不充分　　流動(dòng)相受熱，或者流動(dòng)相不同組分混合時(shí)會(huì)有氣體產(chǎn)生，氣泡進(jìn)入泵內(nèi)引起壓力波動(dòng)，增加噪音，色譜圖上出現(xiàn)毛刺?？稍囉孟铝蟹椒ń鉀Q問題：流動(dòng)相再脫氣;采用更有效的脫氣方法或兩種方法配合使用;改系統(tǒng)內(nèi)混合為系統(tǒng)外預(yù)混合?！　?2、流動(dòng)相供給不暢　　流動(dòng)相用完，管道中吸入氣體引起泵壓力不穩(wěn)。應(yīng)經(jīng)常觀察儲(chǔ)液器中流動(dòng)相的量，加足流動(dòng)相保證所有的樣品分析完畢。輸液管道上裝沉子沉至瓶底，儲(chǔ)液器蓋上留一小孔正好夾住進(jìn)液管，使其不能上下移動(dòng)?！　∵^濾器阻塞引起管道和泵腔空化，壓力不穩(wěn)。過濾器被微粒所阻塞或長霉，去掉過濾器后如果系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)正常，說明已找出問題，換上新的過濾器則可。有時(shí)候換上新的過濾器仍然不暢，那就需要查查流動(dòng)相的制備過程，或者換大孔徑的過濾器。不管如何，流動(dòng)相都需要重新過濾?！　×魉龠^高、阻力大，造成空化現(xiàn)象，這是由于過濾器孔徑、管道內(nèi)徑、流速和溶劑黏度等引起的。如果流速大于10mL/min，常會(huì)出現(xiàn)這種現(xiàn)象?！　∈褂孟铝蟹椒ń鉀Q：　　(1)使用低流速;　　(2)換大孔徑的過濾器;　　(3)增加進(jìn)液管道內(nèi)徑;　　(4)抬高或加壓儲(chǔ)液器;　　(5)不用過濾器，但流動(dòng)相**要先過濾;　　(6)儲(chǔ)液器蓋子太緊，在儲(chǔ)液器內(nèi)形成真空，打出的流動(dòng)相不連續(xù)。應(yīng)松開蓋子或留有1mm的縫隙;　　(7)進(jìn)液管道阻塞或彎曲使泵抽不到液，注意調(diào)整進(jìn)液管道或更換新的。其它問題包括滲漏或接頭松動(dòng)、泵部件損壞等，都能引起供液不正常。　　03、流動(dòng)相和儲(chǔ)液器被污染　　由于污染，噪音越來越大，檢測器基線上升。污染物可能被泵以穩(wěn)定的濃度打入系統(tǒng)，而再以穩(wěn)定的濃度流出來，所以在色譜圖中不出多余的峰。用梯度洗脫時(shí)弱流動(dòng)相可以使污染物聚在柱頂，流動(dòng)相強(qiáng)度增加后污染物可能被洗脫出來一個(gè)大的偽峰。有時(shí)基線噪音突然增大或突然提高，都是因?yàn)榉磸?fù)加進(jìn)新的流動(dòng)相或系統(tǒng)用得太久(通宵)所造成的。新加進(jìn)的流動(dòng)相有污染物或者流動(dòng)相長霉，繁殖了**?！　∨K的儲(chǔ)液器會(huì)污染清潔的流動(dòng)相。每種流動(dòng)相備有專用的儲(chǔ)液器，或者定期報(bào)廢儲(chǔ)液器?！　×鲃?dòng)相污染來自這幾個(gè)方面　　04、試劑質(zhì)量不高，玻璃器皿不合格;　　微生物的影響;　　配制流動(dòng)相時(shí)操作不當(dāng)?shù)?　　因此要求高純度化學(xué)試劑和HPLC級(jí)溶劑;　　玻璃器皿按規(guī)定清洗干凈;　　為防止微生物生長，每天要用甲醇清洗系統(tǒng);　　懷疑系統(tǒng)內(nèi)生長了微生物，可用稀硝酸沖洗即可(注意不要損壞柱和管道系統(tǒng));　　真空脫氣時(shí)防止泵油帶入流動(dòng)相;　　用清潔的惰性塞子、攪棒、過濾器和玻璃器皿配制流動(dòng)相;　　已經(jīng)污染的流動(dòng)相**要廢棄掉。